Introducción a la cromatografía en capa delgada (TLC)

Actualizado en julio 29, 2021

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La cromatografía en capa delgada o TLC es una de las aproximaciones más sencillas a la cromatografía, con muchas aplicaciones y utilidades en enseñanza e investigación.

Muchos estudiantes tienen contacto con la cromatografía temprano en su carrera académica, ya sea en la escuela primaria o en la química general. Lo más probable es que se trate de cromatografía en papel (Figura 1), ya que los materiales son baratos, pero aun así eficaces. La cromatografía en papel puede utilizarse para separar los colorantes de los bolígrafos, marcadores y colorantes alimentarios.

Cuando los componentes se separan utilizando cromatografía de papel es porque los componentes de las mezclas tienen diferentes interacciones en la fase estacionaria (la celulosa en el papel) y en la fase móvil (el disolvente que absorbe el papel), y pasan diferentes cantidades de tiempo en cada una. La cromatografía de capa fina (TLC) es una extensión de la cromatografía de papel y utiliza una fase estacionaria diferente.

Características de la cromatografía en capa delgada

Dos fases estacionarias comúnmente utilizadas en la cromatografía son la sílice (SiO₂⋅xH₂O) y la alúmina (Al₂O₃⋅xH₂O). Ambos materiales son polvos blancos y finos que, a diferencia del papel, no se mantienen unidos por sí mismos, por lo que se depositan en una fina capa sobre algún tipo de soporte (ya sea vidrio, aluminio o plástico). El uso de estas delgadas capas de fase estacionaria para las separaciones es el origen del nombre «cromatografía de capa fina» (Thin Layer Chromatography – TLC), y se realiza por procedimientos muy parecidos a la cromatografía de papel (Figura 2).

Es muy común que los compuestos orgánicos aparezcan incoloros en el fondo blanco absorbente, lo que plantea el reto de ver la separación que se produce en una TLC. Las placas de TLC a menudo tienen que ser «visualizadas» o “reveladas” como en una fotografía análoga, lo que significa que hay que hacer algo en la placa para ver temporalmente los compuestos. Los métodos comunes de visualización son el uso de luz UV (Figuras 3 a+b) o una mancha química (Figura 3c).

Usos de la cromatografía de capa delgada

La TLC es una técnica común en el laboratorio de química orgánica porque puede dar información rápida y útil sobre la pureza de una muestra y sobre si una reacción en curso está completa o no. Cuando se utilizan disolventes de baja polaridad, una placa de TLC puede estar lista en menos de 5 minutos.

Evaluación de la pureza

Uno de los usos de la TLC es evaluar la pureza de una muestra. En la figura 4 están las placas de TLC de acetofenona y cinnamaldehído: muestras que fueron diluidas de su frasco de reactivo, corridas y visualizadas con luz UV. La acetofenona apareció como una sola mancha en la placa de TLC, lo que indica que el reactivo es probablemente puro.

Por el contrario, el cinamaldehido es sin duda impuro ya que su cromatograma mostraba dos grandes manchas, y también tenía algunas manchas más débiles. Los aldehídos son propensos a la oxidación del aire, y es común encontrar aldehídos en sus botellas de reactivos junto con sus correspondientes ácidos carboxílicos. La TLC es un método que puede ser usado para determinar cuánto se ha degradado un aldehído.

Evaluación del progreso de la reacción

Uso de un Co-Spot

La cromatografía en capa delgada se puede utilizar para analizar una reacción química, por ejemplo, para determinar si los reactivos se han consumido y se ha formado un nuevo producto. Una muestra pura del reactivo se puede ver en una pista de una TLC, y la mezcla del producto en otra pista. A menudo se utiliza el carril central como referencia, donde tanto el reactivo como la mezcla de productos se localizan uno encima del otro, en lo que se denomina «co-spot».

Por ejemplo, la reacción que se muestra en la Figura 5a se analiza mediante la TLC en la Figura 5b. En el primer carril de la Figura 5b (marcado F) se ve una muestra pura del reactivo ferroceno. En el último carril (marcado AF) se ve la mezcla del producto, que se supone que es acetil-ferroceno. En el carril central (marcado como co) se ve tanto el ferroceno puro como la mezcla de productos. El carril derecho de la «FA» muestra que la reacción parece ser un éxito: el punto más alto de ferroceno está ausente (lo que significa que ha sido consumido), y un nuevo punto de producto está presente. Habría que hacer más pruebas para confirmar que la mancha inferior es el producto esperado del acetil-ferroceno, pero los resultados de la TLC parecen prometedores.

El co-spot se utiliza como referencia y puede ser útil para interpretar ciertas situaciones. Por ejemplo, a veces el disolvente puede funcionar con una ligera diagonal, lo que hace que componentes idénticos se eluyan a alturas ligeramente diferentes. El co-spot puede ser útil para rastrear esas variaciones.

También puede ser útil para identificar manchas como diferentes si tienen valores de R_f similares (una característica de la que es difícil estar seguro en la figura 6a). Dos compuestos con valores de R_f ligeramente diferentes eluidos uno encima del otro en el carril del copunto pueden producir un punto con una forma alargada (Figura 6b), lo que hace más evidente que son compuestos diferentes. Además, un co-spot puede ser útil para descifrar una placa de TLC si el disolvente de la reacción persiste en el carril de mezcla del producto (por ejemplo, si el disolvente tiene un punto de ebullición relativamente alto como DMF o DMSO), de manera que el disolvente residual tiene un efecto en los valores R_f del componente.

Monitoreo de una reacción por cromatografía en capa delgada

La TLC puede ser usada para monitorear el progreso de una reacción. Este método se utiliza a menudo en la investigación, y en la figura 7 se muestra un artículo de revista que informa sobre su uso.

Para utilizar la TLC de esta manera, se ven tres carriles en una placa de cromatografía: uno para el reactivo limitante, uno para el co-punto y uno para la mezcla de reacción. El objetivo es notar la desaparición del reactivo limitante en la línea de la mezcla de reacción y la aparición de un nuevo producto. Cuando el reactivo limitante ha desaparecido completamente, el químico deduce que la reacción se ha completado, y puede entonces «trabajar».

Para demostrar cómo se puede utilizar la TLC para monitorizar una reacción, se estudió la reacción de transesterificación de la Figura 8 a lo largo del tiempo (Figura 9). En el primer carril de cada placa de TLC (marcado «BA») se observó una muestra diluida del reactivo acetato de bencilo, mientras que en el tercer carril de cada una se observó la mezcla de la reacción (marcada «Pr») en diferentes momentos. En la vía central (marcada «Co» para la mancha conjunta), tanto el acetato de bencilo como la mezcla de reacción se entregaban uno encima del otro.

La figura 9 muestra el progreso de la reacción a lo largo del tiempo. En la figura 9a, en la que el tercer carril representa la mezcla de la reacción después de un minuto de mezcla, un punto débil cerca del centro de la placa corresponde al acetato de bencilo que no ha reaccionado. Un nuevo punto aparece debajo de él, representando el producto de alcohol bencílico. Con el tiempo (figura 9b-e), el punto superior de acetato bencílico desaparece en la línea de la mezcla de reacción, y el punto inferior de alcohol bencílico se intensifica. De las placas de TLC se desprende que la reacción se estaba acercando a su fin a los 10 minutos, y se completó a los 20 minutos. La TLC demuestra que la mezcla de la reacción podía ser trabajada después de 20 minutos de mezclarse.

Obtención de una alícuota de una reacción en curso

Para monitorear el progreso de una reacción por medio de la TLC, se necesita una «alícuota» (o una pequeña muestra) de la mezcla de la reacción.

Si la reacción se realiza a temperatura ambiente o con un calentamiento leve, y la concentración de reactivos es propicia para la TLC, se puede insertar directamente un tubo capilar o tubo de siembra en el matraz en el que se está produciendo la reacción (figura 10a). Un tubo con punta delgada y larga es ideal si se dispone de uno. La alícuota puede entonces ser sembrada directamente en la placa de cromatografía líquida.

Si se espera que la muestra sea activa con luz UV, es una buena idea ver la placa TLC bajo luz UV antes de eluir la placa. Si la mancha de la muestra no es visible antes de la elución, no será visible después, ya que los compuestos se difunden durante la elución.

Si se espera que la muestra sea UV activa, y sólo se ve un ligero indicio de material en la línea de base, el material puede depositarse varias veces antes de la elución (Figura 10b): coloque un pequeño punto de muestra en la línea de base, y déjelo secar completamente antes de colocar otro punto sobre el primero. Si no se deja secar los puntos entre las aplicaciones, el punto será demasiado grande. Revise la plancha bajo luz ultravioleta de nuevo, y si es necesario repita el procedimiento más veces.

Es importante dejar que una mancha se seque completamente en la placa de TLC antes de colocarla en la cámara de elución. En la Figura 10c la mancha de la mezcla de reacción (etiquetada Pr) no se secó completamente antes de la elución, y el disolvente de etanol probablemente afectó la apariencia de la parte inferior del punto R_f.

En la figura 10d la muestra se dejó secar completamente antes de la elución, y el punto Rf inferior era más distintivo. Además, el etanol residual era probablemente la razón por la que el compuesto manchado en el carril de reactivos (etiquetado como «BA») tenía un R_f diferente del que tenía en el carril central del co-spot («Co»).

Para obtener una alícuota de una solución en reflujo, se retira brevemente el condensador y se inserta un sembrador en la mezcla de reacción (figura 10e). Vuelva a conectar inmediatamente el condensador y ajuste las pinzas mientras sostiene la alícuota. Alternativamente, levante el matraz de la fuente de calor para detener temporalmente el reflujo antes de insertar el spotter. Es posible que la muestra pueda ser manchada directamente en la placa de TLC, pero si está demasiado concentrada puede diluirse primero haciendo pasar un disolvente apropiado (por ejemplo, acetona) a través de la pipeta y mezclando con la alícuota en un frasco pequeño.

Para más información 2.2A: Overview of TLC

• Procedimiento para una cromatografía en capa delgada (TLC)
• Técnicas de revelado de TLC (I)
• Teoría detrás de la cromatografía en capa delgada (TLC)
• Fraccionamiento de proteínas por solubilidad – Método de Biuret para cuantificación de proteínas