Cuantificación de Riboflavina (Vitamina B₂) por espectrofluorimetría
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La riboflavina, más conocida como vitamina B₂, es un compuesto orgánico esencial para el metabolismo celular y la producción de energía en los seres vivos. Se encuentra de forma natural en muchos alimentos y se añade a otros como suplemento nutricional, por ejemplo, en bebidas energéticas y complejos multivitamínicos.
Una característica molecular interesante de la riboflavina es su capacidad para emitir luz (ser fluorescente) después de absorberla. La espectrofluorimetría es una técnica instrumental extremadamente sensible que aprovecha esta propiedad. El objetivo de esta práctica es determinar la concentración de riboflavina en una muestra problema mediante la medición de su intensidad de fluorescencia y la construcción de una curva de calibración. 🔬
Marco Teórico
La fluorescencia es un tipo de luminiscencia que ocurre cuando los electrones de una molécula absorben energía lumínica de una fuente externa, pasando de un estado energético basal a un estado excitado. Este estado es inestable, y los electrones tienden a regresar a su estado basal casi de inmediato. Parte de la energía absorbida se disipa como calor, y el resto se emite en forma de luz.
Debido a la pérdida de energía no radiativa (calor), la luz emitida siempre tiene una energía menor —y por lo tanto una longitud de onda mayor— que la luz de excitación. Este fenómeno se conoce como desplazamiento de Stokes (Stokes Shift).
Para soluciones diluidas, la intensidad de la fluorescencia emitida (F) es directamente proporcional a la concentración (C) del compuesto fluorescente. Esta relación se expresa como:
$$F = k cdot C$$
Donde k es una constante de proporcionalidad que depende de factores como la naturaleza de la sustancia y las condiciones instrumentales. Esta linealidad permite crear una curva de calibración con soluciones de concentración conocida y, a partir de ella, determinar la concentración de una muestra desconocida.
Materiales y equipos
- Espectrofluorómetro
- Cubetas de cuarzo para fluorescencia
- Balanza analítica
- Matraces aforados (50 mL, 10 mL)
- Pipetas volumétricas
- Vaso de precipitados
- Placa de calentamiento o baño de ultrasonidos (opcional)
Reactivos
- Riboflavina pura (estándar de referencia)
- Solución de Ácido Acético (0.02 M)
- Muestra problema (ej. bebida energética, tableta multivitamínica disuelta, etc.)
Procedimiento Experimental – Cuantificación de Riboflavina (Vitamina B₂) por espectrofluorimetría
Parte 1: Preparación de Soluciones
1. Solución Madre (Stock) – 50 µg/mL:
* Pesar con precisión 2.5 mg de riboflavina pura en una balanza analítica.
* Disolverla en un matraz aforado de 50 mL, utilizando la solución de ácido acético 0.02 M como disolvente. Enrasar hasta la marca.
* *Nota: La riboflavina puede tardar en disolverse. Se puede acelerar el proceso calentando suavemente o usando un baño de ultrasonidos.*
2. Preparación de Soluciones Estándar:
* A partir de la solución madre, preparar una serie de 5 soluciones estándar en matraces aforados de 10 mL. Las concentraciones finales deben ser: 0.2, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 µg/mL.
* *Deberás calcular el volumen de solución madre necesario para cada dilución usando la fórmula $C_1V_1 = C_2V_2$.*
Parte 2: Medición en el Espectrofluorómetro
1. Configuración del Instrumento:
* Encender el espectrofluorómetro y dejar que se estabilice.
* Configurar la longitud de onda de excitación en 450 nm.
* Establecer el rango de barrido de emisión de 460 nm a 800 nm.
2. Medición de los Estándares:
* Usar la solución de ácido acético 0.02 M como blanco para calibrar el instrumento a cero.
* Medir el espectro de emisión de cada una de las 5 soluciones estándar, comenzando por la de menor concentración.
* Registrar la máxima intensidad de fluorescencia para cada estándar, que se observará en el pico de emisión (aproximadamente a 526 nm).
3. Medición de la Muestra Problema:
* Bajo las mismas condiciones instrumentales, medir la intensidad de fluorescencia de la muestra problema y registrar el valor máximo en el pico de emisión.
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Después del Experimento
1. Construcción de la Curva de Calibración:
* En una hoja de cálculo o en papel milimetrado, crea un gráfico con la Concentración (µg/mL) en el eje X y la Intensidad de Fluorescencia (en unidades arbitrarias) en el eje Y.
* Los puntos de tus cinco estándares deben formar una línea recta.
2. Obtención de la Ecuación de la Recta:
* Aplica una regresión lineal a los datos para obtener la ecuación de la recta ($y = mx + b$) y el coeficiente de correlación ($R^2$).
* En esta ecuación, y es la Intensidad de Fluorescencia y x es la Concentración. Un $R²$ cercano a 1 (ej. > 0.99) indica una buena calibración.
3. Cálculo de la Concentración Desconocida:
* Sustituye la intensidad de fluorescencia de tu muestra problema ($F_{problema}$) en la ecuación como el valor de y, y despeja x para encontrar la concentración:
$$C_{problema} = frac{F_{problema} – b}{m}$$
* El resultado será la concentración de riboflavina en la muestra problema, expresada en µg/mL.
Preguntas Adicionales
1. ¿Por qué en un espectrofluorómetro el detector se coloca a 90° respecto a la fuente de luz, a diferencia de un espectrofotómetro de absorbancia?
2. ¿Qué es el desplazamiento de Stokes y por qué la longitud de onda de emisión (526 nm) es mayor que la de excitación (450 nm)?
3. La espectrofluorimetría es conocida por su alta sensibilidad. ¿Qué ventajas ofrece esta técnica sobre la espectrofotometría de absorbancia para analizar concentraciones muy bajas de una sustancia?
Recomendaciones de Seguridad
- Es obligatorio el uso de bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes en todo momento.
- El ácido acético, aunque diluido, es irritante y corrosivo. Manipularlo con cuidado.
- Las cubetas de cuarzo son frágiles y costosas. Deben manipularse con cuidado, sujetándolas por las caras esmeriladas para no interferir con la medición.
- Desechar todas las soluciones en los contenedores de residuos químicos designados, no por el desagüe.
