Cromatografía en capa fina bidimensional (TLC 2D)

La técnica de cromatografía en capa fina bidimensional (TLC 2D) es uno de los métodos más versátiles de desarrollo de la TLC. La primera aplicación del método cromatográfico bidimensional a la cromatografía de papel fue reportada en 1944 por Consden, Gordon y Martin [Nyiredy, Sz.; Dallenbach-Tölke, K.; Sticher, O. J. Planar Chromatogr. 1988, 1, 336].

Desde entonces, este método se ha utilizado principalmente para la separación de un gran número de compuestos que no pueden separarse en un experimento de cromatografía líquida unidimensional.

En la TLC 2D, la separación se realiza en una superficie extendida a lo largo de toda el área de la placa. El poder de resolución del método de TLC en 2D tiene una gran aplicación, especialmente en las áreas de la bioquímica, la biología, los productos naturales, los productos farmacéuticos y el análisis medioambiental.

Otra de ventajas de las TLC bidimensionales es que son útiles para determinar si su compuesto es estable en sílice o para muestras que contienen un gran número de componentes.

Requisitos y características de una TLC 2D

Como el principio de separación es el mismo que en una cromatografía en capa delgada tradicional, la cromatografía en capa delgada bidimensional va a tener las mismas consideraciones que su homologa en una sola dimensión o dirección. La elección de solventes y el manejo y siembra de muestras se realizará de manera análoga que su contraparte.

Sin embargo, esta técnica permite cambiar la solución eluyente cuando se realiza la segunda elución, dando la posibilidad de alterar la capacidad de solvatación del sistema y mejorando la capacidad de separación de muestras complejas.

Otro uso de interés de esta técnica es comprobar si un compuesto o varios presentes en la muestra son estables con relación a la fase estacionaria de la cromatografía. Si en una TLC 2D un compuesto tiene la misma velocidad en cualquier dirección empleando el mismo eluente, se considera estable, si por el contrario, se observa una menor velocidad al volver a eluir el sistema, se puede considerar que el o los compuestos reaccionan con la fase estacionaria, y por lo tanto, no es posible separar de manera adecuada empleando los parámetros de experimentación ensayados.

Procedimiento paso a paso de TLC 2D

Tiempo necesario: 50 minutos.

Paso a paso para una cromatografía en capa fina bidimensional (TLC 2D)

  1. Corta la hoja de TLC en un cuadrado. Un buen tamaño es de 7 cm x 7 cm, pero asegúrese de que esto encaje en su contenedor de disolvente primero.

  2. Vierte el disolvente o disolventes que usarás para la columna en el contenedor de vidrio. El disolvente debe tener una profundidad de 2 a 3 mm para que la muestra manchada no quede sumergida. Esto asegura que la muestra no se disuelva en el disolvente y suba por la placa de TLC con el disolvente.

  3. Utilice un sembrador capilar o una micropipeta para “localizar” alguna de sus muestras en el plato de la esquina inferior izquierda. El punto debe estar aproximadamente a 0,5-1 cm de los bordes inferior e izquierdo y a 1-2 mm de diámetro.

  4. Ponga la tira de TLC en el recipiente con el disolvente o disolventes.

  5. Espera y revisa el TLC 2D regularmente. No mueva o altere la placa o el recipiente de la TLC ya que esto causará ondulaciones en el disolvente y un progreso irregular del frente del disolvente hacia arriba de la placa.

  6. Cuando el frente del disolvente esté a 0,5-1 cm de la parte superior de la placa, retire cuidadosamente la placa del recipiente con unas pinzas.

  7. Deje que el disolvente se evapore.

  8. Gire la placa 90° para que el punto de muestra original esté en la esquina inferior derecha. Los puntos componentes (si son visibles a simple vista) formarán una línea horizontal a lo largo de la parte inferior de la placa.

  9. Vuelva a colocar la placa de TLC en el recipiente con el disolvente o los disolventes.

  10. Espere y compruebe la TLC regularmente. No mueva ni altere la placa o el recipiente de la TLC.

  11. Cuando el frente del disolvente esté a 0,5-1 cm de la parte superior de la placa, retire cuidadosamente la placa del recipiente con unas pinzas.

  12. Deje que el disolvente de la placa se evapore y luego visualicen la placa utilizando una lámpara UV o una inmersión de permanganato de potasio.

  13. Marque con lápiz la posición de todas las manchas. Dibujen una línea diagonal desde la esquina donde la muestra fue manchada, a través del punto de la muestra, hasta la esquina opuesta. Los compuestos que son estables en sílice aparecerán en la diagonal. Si un compuesto se descompone sobre sílice, su mancha estará por debajo de la línea diagonal

¿Que hago si mi compuesto no es estable?

Si descubre que su compuesto no es estable sobre la sílice, considere la posibilidad de utilizar alúmina, o una técnica de purificación alternativa, como la cristalización o la destilación. También puede ser posible posponer la purificación de su compuesto y llevar la muestra completa al siguiente paso de su secuencia. Dependiendo de la siguiente reacción, su compuesto puede convertirse en algo más estable hacia la sílice y más fácil de purificar

Para más información Tips and Tricks for the Lab: Column Troubleshooting and Alternatives