Preparación de etanol por fermentación

La fermentación se define generalmente como la conversión de los carbohidratos en ácidos o alcoholes.  La conversión del azúcar del maíz (glucosa) en etanol por medio de la levadura en condiciones anaeróbicas es el proceso utilizado para hacer el combustible renovable para el transporte, el bioetanol.

Un fermentador funciona mediante la inoculación de un medio de azúcar complejo con un microorganismo.  Por lo general, se permite que este microorganismo se reproduzca en condiciones aeróbicas antes de que el fermentador pase a condiciones anaeróbicas para producir metabolitos secundarios como el etanol.   Las fuentes de carbono como la glucosa (C6H12O6) sirven para dos propósitos: como material de construcción para la biosíntesis y para la energía.  En general, la levadura utiliza la glucosa de tres maneras: para la producción de energía, crecimiento (división de las levaduras) y metabolitos secundarios, entre los cuales está el etanol.

Curvas de crecimiento en fermentación

En condiciones de cultivo por lotes, el crecimiento microbiano suele seguir un ciclo de cinco fases desde la inoculación hasta la muerte celular.  Estas fases pueden verse a continuación como un promedio sobre todas las células vivas de la población.  Las curvas de crecimiento basadas en las lecturas de DO (densidad óptica) tendrán un aspecto ligeramente diferente utilizando las lecturas de DO, ya que las células vivas y muertas no se distinguen utilizando la absorbancia.

Grafica crecimiento fermentación
Gráfica crecimiento en fermentación alcoholica

La primera fase, o fase de retardo, ocurre directamente después de la inoculación como el microorganismo se adapta metabólicamente a su nuevo entorno.  La segunda fase es la exponencial o fase de crecimiento logarítmico donde las células exhiben un crecimiento equilibrado, lo que significa que la masa y la densidad celulares crece exponencialmente con el tiempo a la misma velocidad.

X y X0 son concentraciones de masa celular (g/L) en el tiempo t (horas) y µ (por hora) es la tasa de crecimiento de la masa celular específica. El período de crecimiento exponencial se caracteriza por una línea recta en una curva de crecimiento de ln(X) vs. tiempo.  El tiempo para doblar la masa celular, τd (horas), se puede calcular a partir de:

En algún momento durante la fase de crecimiento exponencial, el agotamiento de uno o más nutrientes esenciales, o la acumulación de subproductos tóxicos del crecimiento, alcanza un punto en el que ya no es posible un crecimiento rápido y equilibrado.  Durante esta tercera fase, la desaceleración o fase de crecimiento en declive, las células tienen que volver a adaptarse metabólicamente, esta vez para aumentar potencial de supervivencia en lugar de maximizar el crecimiento de las células.  En los cultivos por lotes, esta fase es generalmente muy corto.

El crecimiento de las células se ralentiza hasta que la tasa de crecimiento es cero (tasa de crecimiento = tasa de mortalidad) y las células entran en la fase estacionaria.  Durante este tiempo, el metabolismo de las células cambia de produciendo metabolitos primarios relacionados con el crecimiento (más células) a secundarios, sin crecimiento, metabolitos (etanol).

Las células deben descomponer o catabolizar sus reservas para nuevas energía y monómeros de bloque de construcción para mantener una membrana celular energizada, nutriente transporte y reparación de la estructura celular. Este proceso se llama metabolismo endógeno y proporciona energía de mantenimiento.  En el caso de esta fermentación, el inicio de la estacionaria se produce poco después de que el reactor se conmuta a condiciones anaeróbicas, lo que aumenta la producción de etanol, que finalmente es tóxico para la levadura.

La fase final es la fase de muerte o decadencia.  En este punto, el agotamiento de los nutrientes o la acumulación de toxinas es tan grande que la tasa de muerte celular excede la tasa de crecimiento.

Determinación del rendimiento de fermentación

Una forma de seguir la fermentación es calcular los factores de rendimiento, escritos en Y mayúscula con dos subíndices que denotan producto y sustrato.  Por ejemplo, YX/S es el factor de rendimiento para la cantidad de masa celular (g de levadura) por cantidad de sustrato (g de glucosa consumida), y es igual a:

El factor de rendimiento puede calcularse al final de la fermentación para evaluar el rendimiento global, pero también para un período de tiempo específico durante la fermentación para comparar las tasas de mayor crecimiento. Los factores de rendimiento típicos observados para S. cerevisiae cultivada aeróbicamente con glucosa son de alrededor de 0,5 g/g, con rendimientos significativamente menores en condiciones anaeróbicas.

YP/S significa la cantidad de producto (g de etanol) producido por la cantidad de sustrato (g de glucosa) consumido y se calcula de la misma manera:

La cantidad de glucosa utilizada para la energía celular puede estimarse mediante una simple ecuación de equilibrio de masas y ecuaciones estequiométricas aproximadas que relacionan la cantidad de glucosa consumida con la cantidad de etanol o biomasa producida:

A continuación, se detallará el procedimiento para la fermentación de azúcar (glucosa) para la producción de etanol tanto a escala laboratorio como de semi planta piloto, teniendo en cuenta las consideraciones necesarias para cada una de las practicas.

Materiales

  • Erlenmeyer de 250 mL, 4000 mL y 1000 mL
  • Vaso de precipitados de 100 mL
  • Vaso de precipitados de 500 mL
  • Plancha de calentamiento
  • Tubo de ensayo
  • Pinza para tubos de ensayo
  • Algodón
  • Sello de fermentación de plástico o vidrio o Airlock

Reactivos

  • Azúcar (glucosa)
  • Agua destilada
  • Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
  • Solución de hidróxido de calcio saturada
  • Peptona
  • Solución de ácido sulfúrico 10%

Procedimiento

Fermentación a escala laboratorio

Pesar 5 g de glucosa (azúcar) en el erlenmeyer y agregar 50 mL de agua tibia. Agitar para disolver la glucosa

Pesar 1 g de levadura en un vidrio de reloj y transferir al erlenmeyer. Agitar suavemente y colocar un tapón de algodón ligeramente suelto en la boca del erlenmeyer (El tapón debe ser lo suficientemente duro para evitar que entre contaminación al erlenmeyer, pero no obstruir la salida de gas)

Dejar por espacio de 1 a 2 horas para que suceda la fermentación.

Remover el tapón de algodón y verter el gas generado (invisible) en un tubo de ensayo con una cantidad de solución de hidróxido de calcio saturada. Procurar que no se pase liquido al tubo de ensayo.

Agitar suavemente el tubo de ensayo y observar.

Fermentación a escala semi planta piloto

La fermentación a una escala mayor requiere de ciertas condiciones para que se desarrolle de forma óptima. La levadura requiere de una fuente adicional de nutrientes diferente a la glucosa para asegurar un optimo desarrollo, por esta razón es necesario agregar peptona, que sirve de fuente de aminoácidos, vitaminas entre otros.

En un erlenmeyer de 4000 mL adicionar 2000 mL de agua destilada, una barra de agitación y colocar sobre una plancha de agitación, iniciar la agitación.

Pesar en un vaso de precipitados 60 g de peptona, adicionar lentamente al erlenmeyer mientras se mantiene la agitación. La peptona tendera a absorber agua y quedarse en la superficie, aumentar la agitación si es necesario para completa disolución.

Pesar 30 g de levadura y agregar al erlenmeyer. Agregar 500 mL mas de agua destilada y mantener la agitación hasta no observar turbidez (esto puede tomar varios minutos).

Con ayuda de un pH-metro o papel indicador apropiado, ajustar el pH de la solución a 4.5 adicionando gota a gota solución de ácido sulfúrico al 10% mientras se agita.

En un erlenmeyer de 1000 mL, colocar 200 mL de agua destilada y 50 g de azúcar, agitar y calentar suavemente para completa disolución. Agregar agua tibia hasta aforar a 450 mL aproximadamente y reservar.

Agregar al erlenmeyer de 4000 mL el contenido del Erlenmeyer preparado anteriormente, dejar en agitación suave y tapar la boca del erlenmeyer con ayuda de un tapón de cauco con un orificio y un sello de fermentación o Airlock lleno hasta la mitad de la capacidad con agua destilada, una solución de hipoclorito de sodio al 5% o etanol al 70%.

Sello de fermentación o Airlock
Sello de fermentación o Airlock

Dejar que la fermentación ocurra. Observando el sello de fermentación se puede observar la evolución de dióxido de carbono que indica que la fermentación está sucediendo, lo que puede suceder por varios días. En el momento en que no se observe más producción de gas, se puede considerar que la fermentación ha terminado

Para poder concentrar el alcohol (etanol) obtenido primero se debe decantar y filtrar el líquido y proceder a realizar una destilación fraccionada, recogiendo la fracción rica en etanol entre 75 – 85°C.

Notas sobre la fermentación

La fermentación a grandes escalas implica muchas variables que no son tenidas en cuenta cuando se realiza a nivel laboratorio. Una de estas variables es la temperatura ambiente. La temperatura ideal para una fermentación alcohólica es entre 32 – 35°C. Si la temperatura ambiente es bastante mas baja o varia fuertemente, es recomendable emplear algún sistema de calentamiento suave o cubrir el recipiente de fermentación con telas para disminuir la perdida de calor generada por fermentación.

Los valores dados aquí son aproximados y pueden ser variados según la observación del investigador. Las levaduras pueden tener diferentes rendimientos dependiendo de factores como la edad del cultivo, subespecie de levadura entre otros. Algunas levaduras podrán procesar más azúcar (glucosa) que otras antes de inactivarse.

En caso de no disponer un sello de fermentación o Airlock se puede improvisar empleando un recipiente pequeño comunicando la salida de gas del recipiente que se emplea como fermentador a un recipiente de menor tamaño con líquido, generalmente agua, a través de una manguera de goma. La salida de gas debe estar lo más cerca posible de la boca para evitar que la espuma generada pase a través de la manguera, pero en el otro recipiente la salida de la manguera debe estar en el fondo del liquido para asegurar un sello liquido hermético que evite la entrada de contaminación del exterior y permita la salida de dióxido de carbono.

Esquema de sello de fermentación empleando otro recipiente, nótese que el extremo de la manguera en el fermentador esta cerca de la tapa mientras que el otro se encuentra sumergido en liquido
Esquema de sello de fermentación empleando otro recipiente, nótese que el extremo de la manguera en el fermentador esta cerca de la tapa mientras que el otro se encuentra sumergido en liquido

El liquido que se emplea en los sellos de fermentación puede ser agua, aunque es recomendable emplear un liquido con capacidad bactericida para disminuir el impacto de contaminaciones biológicas. Una solución de hipoclorito de sodio es eficaz, aunque se puede emplear alcohol al 70%.

Otra alternativa para el sello de fermentación es utilizar un globo de goma (como el empleado en fiestas) donde se le practica un pequeño agujero. El globo se adapta a la boca del fermentador y se inflará paulatinamente a medida que se genera el dióxido de carbono, y cuando la presión es suficiente, comenzará a escapar por el agujero realizado.

La concentración del alcohol obtenido se puede revisar empleando un refractómetro manual o digital o empleando un alcoholímetro adecuado. El alcohol obtenido después de la fermentación debe tener un olor característico a etanol, aunque se pueden presentar otros tonos como ácido acético, formaldehido entre otros, esto puede ser indicador de la presencia de otros microorganismos en la fermentación.

El éxito de una fermentación depende también de la pericia y experiencia del operador, las primeras fermentaciones pueden no ser exitosas.

Después del laboratorio

Investigar la realización de cálculos estequiométricos en una fermentación y realizar los cálculos correspondientes tanto en la fermentación a escala laboratorio como a escala semipiloto.

Determinar que reacción sucede en el tubo de ensayo en la fermentación a escala laboratorio, escribir la reacción química que sucedió.

¿Qué otros parámetros se pueden emplear para el seguimiento de la fermentación? ¿con que criterios se puede determinar que la fermentación ha finalizado?

¿Qué otras fermentaciones se pueden realizar en medios líquidos? ¿Qué otros productos se pueden obtener a través de fermentación aparte del alcohol (etanol)?

Para más información Fermentation of glucose using yeast

Ethanol from Fermentation

Gracias a Gabriel Prieto por su aporte y aclaraciones