Empaque de columnas – generalidades
La cromatografía en columna es una técnica de purificación y separación de uso común en los laboratorios de todo el mundo. Si se hace bien, puede aislar simple y rápidamente los compuestos deseados de una mezcla. Pero como muchos aspectos de la química práctica, la rápida y eficiente instalación y funcionamiento de una columna es algo que puede llevar años dominar. Aquí presentamos algunos de los consejos y trucos del oficio para ayudarle a configurar la columna perfecta.
En una columna típica (Fig. 1), la fase estacionaria, un sólido adsorbente normalmente gel de sílice (SiO2) o alúmina (Al2O3), se coloca en una columna vertical de vidrio. La fase móvil, un líquido, se añade a la parte superior de la columna y fluye hacia abajo a través de la columna por gravedad o por presión externa (cromatografía flash). La separación de los compuestos se logra mediante la absorción e interacción variables entre las fases estacionaria y móvil.
La calidad de la separación depende de diversos factores, entre los que destaca la ausencia de burbujas de aire en la fase estacionaria. Para evitar las burbujas, es importante el correcto empaquetamiento de una columna.
Elección de sílice o alúmina para la fase estacionaria
Tanto la sílice como la alúmina son adsorbentes polares, de modo que los componentes más polares de la mezcla a separar se retienen con mayor fuerza en la fase estacionaria y, por lo tanto, se eluyen de último en la columna. La sílice se recomienda para la mayoría de los compuestos, pero como es ligeramente ácida, retiene preferentemente los compuestos básicos. La alúmina es ligeramente básica, por lo que retendrá los compuestos ácidos con más fuerza. Es buena para la separación de los componentes que son débil o moderadamente polares y para la purificación de las aminas.
El tamaño de las partículas absorbentes afecta a la forma en que el disolvente fluye a través de la columna. La sílice o la alúmina están disponibles en una variedad de tamaños.
El tamaño viene dado por el valor de la malla, que se refiere al número de agujeros de la malla que se utiliza para tamizar el absorbente. Así, valores de malla más altos como “gel de sílice 230-400” tienen más agujeros por unidad de área y, en consecuencia, partículas más pequeñas que “gel de sílice 60”. Típicamente, el gel de sílice 70-230 se utiliza para las columnas de gravedad y la malla 230-400 para las columnas flash.
La alúmina está disponible en los tipos I, II y III. Esto se refiere al contenido de agua de la alúmina, siendo I el que menos agua tiene y III el que más. Un menor contenido de agua significa que hay más sitios polares en la alúmina libres para unirse a los compuestos orgánicos, y los compuestos polares permanecerán más tiempo en la columna. La alúmina de actividad II o III, de malla 150, es la más utilizada.
Las técnicas de empaquetamiento de una columna que se describirán en la siguiente entrega utilizan la sílice como fase estacionaria, pero son igualmente adecuadas para su uso con la alúmina.
Preparando la columna
Algunas columnas tienen fritas o discos de vidrio sinterizado (Fig. 2) para evitar la pérdida de la fase estacionaria en el fondo; otras no y tendrán que ser tapadas con lana de vidrio o algodón. Lo que se utiliza es una preferencia personal. La colocación del algodón o de la lana de vidrio puede ser incómoda al principio, pero las fritas de vidrio son más difíciles de limpiar y pueden ser una fuente de impurezas, como la sílice que se filtra a través de la frita en las fracciones recogidas. Esto puede evitarse añadiendo una capa de arena entre la frita y la sílice. La porosidad de las fritas también puede variar. Esto significa que la tasa de flujo de disolvente puede ser diferente para las distintas columnas. Las fritas muy porosas filtrarán más sílice, pero las fritas menos porosas tienen tasas de flujo más lentas, a veces demasiado lentas, y pueden llevar a la acumulación de presión en la cromatografía flash.
Columna con disco de vidrio sinterizado
- Encuentra una columna limpia y vacía de tamaño adecuado.
- Asegure la columna y cierre el grifo o la llave de paso (Fig. 2, 2).
- Añada una capa de arena (aprox. 0,5 cm, opcional).
Columna no frita
La bola de algodón o lana de vidrio debe ser lo suficientemente grande como para tapar la parte inferior de la columna, pero no tan grande y densamente empacada como para restringir el flujo de disolventes (Fig. 3). Un trozo del tamaño de la punta del dedo meñique debe ser adecuado para la mayoría de las columnas.
- Colocar la bola de algodón o lana de vidrio de forma segura en la parte más estrecha de la columna utilizando una varilla de vidrio larga u otro dispositivo adecuado.
- Sujete la columna firmemente y cierre el grifo o la llave de paso (Fig. 2).
- Añada una capa de arena hasta que llegue al cuerpo principal de la columna (aprox. 2 cm, Fig. 3). Esto le dará a la fase estacionaria una base uniforme y evitará la concentración y el rayado de las bandas a medida que se desprenden de la columna y se recogen.
Para más información Tips and Tricks for the Lab: Column Packing
