Cromatografía de pigmentos vegetales

La cromatografía es un método de separación de mezclas como los pigmentos, empleado a menudo en laboratorios de análisis para la separación e identificación de compuestos presentes en una matriz.

Existen una gran cantidad de técnicas cromatográficas, desde las más sencillas (cromatografía en papel y columna) hasta versiones altamente sofisticadas que implican el uso de gases o líquidos a alta presión y fases estacionarias con características químicas determinadas.

Todas las técnicas cromatográficas tienen el mismo fundamento teórico; una fase móvil o eluyente (gas o liquida) que viaja a través de una fase estacionaria solida o semisólida. La separación ocurre debido a que algunos componentes son atraídos con mas fuerza que otros hacia la fase estacionaria mientras que otros tienen más afinidad a la fase móvil.

La palabra cromatografía proviene del hecho que las primeras mezclas en ser separadas a través de esta técnica generaron colores en la fase estacionaria (chromos – color, graphos – imagen).

Cromatografía en papel

La cromatografía es una técnica que se emplea para separar e identificar los componentes de una mezcla. Esta técnica analítica tiene un amplio campo de acción que va desde la industria de alimentos, así como la investigación científica, industria farmacológica y petrolera.

En la cromatografía en papel, la sustancia problema es aplicada a un trozo de papel, bien puede ser papel especializado para cromatografía, pero también se puede emplear papel de filtro o papel común, mientras sus constituyentes no interfieran con la elución de los componentes o interactúen con el solvente a emplear.

La composición básica del papel es celulosa, el cual es un polímero de β glucosa, la cual posee varios grupos hidroxilo en su estructura, dándole la capacidad de atraer moléculas polares como la del agua. La celulosa es denominada la fase estacionaria en la cromatografía en papel.

La fase móvil o solvente de la cromatografía en papel es menos polar y generalmente consiste en la mezcla de uno o varios solventes orgánicos y agua. Los solventes y proporciones para emplear dependerán tanto de la fase estacionaria como de la naturaleza de la muestra a analizar.

La cromatografía en papel consta de tres etapas básicas; 1. Aplicación de la muestra. 2. Desarrollo del cromatograma, que consiste en la elución del solvente junto con la muestra través de la fase estacionaria y 3. Revelado del cromatograma si es necesario y el cálculo de los índices de retención para la interpretación de los resultados.

Las partes de un cromatograma en papel son 1. Solvente, 2. papel cromatografico, 3. Muestra, 4. Puntos de aplicación de muestras, 5. Frente de elución, 6 linea de inicio.

Cromatograma de pigmentos vegetales
Wikimedia commons

Para obtener una medida cuantitativa y comparable de la cantidad de movimiento de un componente en un cromatograma, se desarrolló el parámetro de índice de retención. El índice de retención (Rf) se calcula como la razón de la distancia recorrida por una muestra desde el punto de aplicación con respecto a la distancia recorrida por el frente de elución.

Cada índice de retención es igual para una determinada sustancia bajo las mismas condiciones experimentales (fase estacionaria, fase móvil, etc.) siendo esta una herramienta de utilidad para la identificación de sustancias comparando el índice de retención contra una lista de índices de retención de sustancias conocidas reportados en literatura. La distancia recorrida se toma desde la línea de inicio al punto medio de la mancha dejada por la sustancia

Separación de pigmentos por cromatografía

Los pigmentos vegetales juegan distintos roles. El principal es en la consecución de la energía para el proceso fotosintético en las hojas de la planta. También se encuentran pigmentos en otras partes, como en las flores, donde sus colores sirven como señales para la atracción de insectos polinizadores.

Muchas familias de compuestos se han identificado como pigmentos vegetales, algunos de ellas son las porfirinas, carotenoides, clorofilas, antocianinas y betalainas. Todas estas familias de compuestos, gracias a sus estructuras moleculares, absorben de manera selectiva, ciertas longitudes de onda, mientras reflejan otras, que son las percibidas como el color característico.

Todos los pigmentos tienen una solubilidad distinta en solventes apolares y una distinta afinidad por la fase estacionaria, lo que permite su separación por cromatografía en papel

Materiales para cromatografía

  • 1 beaker (vaso de precipitado) de 600 mL
  • Mortero
  • Embudo
  • Tubo de ensayo
  • Regla
  • Cinta adhesiva
  • Toallas de limpieza
  • Papel cromatográfico o papel filtro
  • Espinacas u hojas verdes

Reactivos

  • Éter etílico
  • Metanol absoluto

Procedimiento

Preparación de extracto de pigmentos

Colocar en el mortero entre 5 y 10 gramos de espinacas u otro material vegetal, procurando quitar las nerviaciones mas gruesas, y 10 mL de éter etílico. Triturar el material vegetal son golpear hasta obtener una coloración verde intensa en el éter. Esta operación se debe llevar a cabo en una campana de extracción de gases.

Tomar el embudo y cortar un trozo de papel de filtro adecuado a su tamaño, filtrar 3 mL del extracto de éter etílico recogiendo el filtrado en un tubo de ensayo.

Preparación del papel cromatografico

Para evitar que la grasa o suciedad presentes en las manos interfieran con el cromatograma, se debe evitar al máximo la manipulación excesiva del papel o emplear guantes. Tomar una pieza rectangular de papel de 15 x 10 cm, colocarla de manera horizontal sobre una toalla de papel limpia para evitar la contaminación y marcarla en la parte superior derecha.

Con ayuda de la regla y de lápiz, dibujar una línea horizontal a una distancia de 1.5 cm del borde inferior del papel. Igualmente, en la parte superior del papel, trazar una línea horizontal a 10 cm del borde inferior. La línea horizontal inferior es la línea de inicio y la línea horizontal inferior la línea de finalización. Las líneas dibujadas con lápiz no se verán afectadas por los solventes

En la línea horizontal inferior (línea de inicio) a 2.5 cm del borde dibujar una equis con lápiz, hacer 6 marcas más en la línea horizontal distantes entre sí 1.5 cm.

En cada una de las equis, colocar unas gotas de solución de éter y dejar secar, cuando estén secas, agregar unas gotas más a cada una de las marcas.

Con la ayuda de dos trozos de cinta adhesiva enrollar el papel para crear un cilindro con las muestras de tinta en la parte inferior del cilindro. Los extremos del cilindro no deben tocarse, ya que esto generaría que el solvente no fluya de manera correcta.

Generación del cromatograma de pigmentos

En un beaker o vaso de precipitados de 600 ml, colocar 25 ml de alcohol metílico y tapar. Colocar el cilindro de papel de manera cuidadosa, de tal manera que las marcas de las muestras (línea de inicio) queden por encima del nivel de la mezcla de solventes, tapar y observar el movimiento de los solventes a través del papel, esto puede tomar entre 45 a 90 minutos.

Cuando el frente del solvente alcance la línea de finalización, extraer cuidadosamente el cilindro y dejar escurrir el exceso de solvente. Procurar solo tocar el papel en la parte superior del mismo. Abrir el cilindro y depositarlo sobre una toalla de limpieza. Dejar secar el cromatograma en una campana de extracción o de gases.

Después del experimento

Analizar el cromatograma obtenido y determinar la cantidad de compuestos o de familias de compuestos con base a la cantidad de manchas y colores que se observen en el cromatograma.

Con la ayuda de la regla, determinar el punto medio de cada mancha generada. Medir la distancia desde la línea de inicio hasta el punto medio de cada mancha. Este será la distancia recorrida por la sustancia.

Medir la distancia desde la línea de inicio hasta la línea de finalización o hasta la distancia que recorrió el solvente, este será la distancia del frente del solvente.

Calcular el índice de retención de cada una de las manchas o pigmentos. Comparar los valores obtenidos entre cada muestra.

De manera aproximada la solubilidad de los pigmentos en éter, de mayor a menor, es carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofilas. Con base a esta información y a los colores observados, clasificar las manchas del cromatograma. Indicar cual de los compuestos o familias es mayoritaria en la muestra.

Recomendaciones de seguridad

En todo momento se deben utilizar los elementos de seguridad básicos en el laboratorio de química (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad y demás que sean exigidos por las normas internas, locales o nacionales. Los residuos generados por la práctica deben ser dispuestos de manera adecuada según las normas de laboratorio y las normas locales y nacionales respectivas.

Mayor información

Leaf Chromatography

Clasificación

Nivel: Superior – universitario

Tipo: Demostración – practica de enseñanza

Riesgo: bajo