Técnicas de laboratorio

Cromatografía en columna

Actualizado en enero 9, 2024

Tiempo de lectura estimado: 28 minutos

Los mismos principios subyacentes de la cromatografía de capa fina (TLC) se aplican a la cromatografía en columna. De hecho, una TLC siempre se ejecuta antes de realizar una columna para evaluar la situación y determinar la proporción adecuada de disolventes. Para obtener una buena separación, lo ideal es que el componente deseado tenga un Rf de alrededor de 0,35 y que esté separado de los demás componentes por lo menos en 0,2 unidades de Rf.


Un Rf cerca de 0,35 es ideal porque es lo suficientemente lento como para que pueda producirse un equilibrio de fase estacionaria-móvil, pero lo suficientemente rápido como para minimizar el ensanchamiento de la banda a partir de la difusión.

Hay algunas variables que no son aplicables a la TLC, pero que afectan a la separación de los componentes en la cromatografía en columna. Entre ellas se incluyen el diámetro de la columna, la cantidad de adsorbente utilizado y la velocidad de flujo de los disolventes. En la tabla 1 se resumen las recomendaciones sobre las variables basadas en el tamaño de la muestra y el grado de separación entre los componentes. En todos los escenarios, las columnas deben prepararse entre 5 y 6 pulgadas de altura (12 – 16 cm).

Tabla 1. Resumen de los valores recomendados para la cromatografía en columna.
Tabla 1. Resumen de los valores recomendados para la cromatografía en columna.

Por ejemplo, una columna de una pulgada de diámetro (1 pulgada es 25,4 mm) debería ser capaz de purificar alrededor de 400mg de material si la separación es buena (ΔRf > 0,2, tercera columna de la Tabla 1), o alrededor de 160mg si la separación es difícil (ΔRf > 0,1). La columna debe poder prepararse y eluirse utilizando alrededor de 200mL de disolvente, y las fracciones pueden recogerse con aproximadamente 10mL de solución cada una.

Existen múltiples variaciones sobre cómo dirigir físicamente una columna, y su instructor puede preferir un determinado método. Una gran diferencia en los métodos es cómo se prepara la columna. En el método de «empaquetado en seco», se añade sílice o alúmina seca directamente a la columna, y se deja que el disolvente se filtre en porciones, y luego con presión.

En el método de «empaquetamiento húmedo», la columna se llena primero con disolvente, luego se agita ligeramente la sílice o la alúmina seca y se empaqueta con presión. En el método «slurry», el disolvente se añade a la sílice o alúmina en un matraz Erlenmeyer, se vierte en la columna como un material de lodo, y luego se empaqueta con presión.

Es importante saber que se libera calor cuando se añade el disolvente a la sílice o la alúmina (tienen un calor exotérmico de disolución). El método del lodo se utiliza en este artículo, con la razón principal de que permite que este paso exotérmico ocurra en un frasco Erlenmeyer en lugar de en la columna. Si se libera calor durante el relleno de la columna, puede generar burbujas por la ebullición del disolvente. Éstas pueden interferir en la separación de la columna si no se eliminan adecuadamente, y pueden agrietar el material adsorbente de la columna.

Procedimiento paso a paso para cromatografía en columna

Figura 1: a) Cromatografía en capa fina de la mezcla de ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografía en columna
Figura 1: a) Cromatografía en capa fina de la mezcla de ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografía en columna

La columna que se muestra en esta sección muestra la purificación de una muestra de 0,20 g que contiene una mezcla de ferroceno y acetilferroceno (la TLC en bruto está en la figura 1a). Se recogieron aproximadamente 8mL de fracciones en pequeños tubos de ensayo, y se utilizaron aproximadamente 400 mL de eluyente.

Figura 2: a) Placa de TLC de la mezcla de ferroceno crudo/acetilferroceno antes de la elución, b) Después de la elución, c) Columna con la frita, d) Columna con el algodón acuñado en el fondo, e) Columna que carece de la cuña de algodón (tendría que ser insertada antes de su uso).
Figura 2: a) Placa de TLC de la mezcla de ferroceno crudo/acetilferroceno antes de la elución, b) Después de la elución, c) Columna con la frita, d) Columna con el algodón acuñado en el fondo, e) Columna que carece de la cuña de algodón (tendría que ser insertada antes de su uso).

Hacer una TLC

  1. Realice una cromatografía de capa delgada o TLC de la muestra que se va a purificar (Figuras 2 a+b) para determinar el disolvente apropiado para la cromatografía. El componente deseado debe tener un Rf de alrededor de 0,35 y lo ideal es que esté separado de todos los demás puntos por al menos 0,2 Rf unidades.
  2. Prepare un lote de eluyente que dé el Rf con valor adecuado. La cantidad preparada depende de la cantidad de la muestra, del tamaño de la columna y de si está previsto modificar la composición del disolvente a mitad de camino. (Véase la tabla 2 para las directrices y la serie eluotropica para las tendencias del «poder disolvente»).

Preparar la columna empaquetada

  1. Obtenga una columna apropiada (ver Tabla 1), y asegúrese de que haya algo cerca de la llave de paso que permita el paso de líquido, pero no de sólido. Las columnas pueden tener un disco sinterizado (también conocido como «frita», Figura 2c), o un tapón de algodón o lana de vidrio remanente del usuario anterior (Figura 2d). Si no hay ningún disco o tapón (Figura 2e), acuñe un pequeño fajo de algodón o lana de vidrio en la parte inferior de la columna utilizando una varilla larga.
Figura 3: a) Verter la sílice hasta 5-6" de altura en la campana extractora, b) Verter el sílice en un matraz Erlenmeyer, c+d) Hacer una lechada
Figura 3: a) Verter la sílice hasta 5-6″ de altura en la campana extractora, b) Verter el sílice en un matraz Erlenmeyer, c+d) Hacer una lechada
  1. Asegure su columna perfectamente vertical a un soporte de anillo o enrejado, sujetándola con abrazaderas de tres dedos en dos lugares. En la campana extractora, vierta gel de sílice o adsorbente de alúmina en la columna a una altura de entre 5 y 6 pulgadas (Figura 3a).

Nota de seguridad: La sílice y la alúmina en polvo son irritantes para los pulmones y siempre deben manejarse con cuidado en una campana extractora. El polvo derramado debe ser eliminado con un trapeador con una toalla de papel húmeda (si está húmedo, las partículas finas son menos dispersivas).

  1. En la campana extractora, vierta el adsorbente medido en la columna en un matraz Erlenmeyer (Figura 3b), y luego añada un poco de eluyente (Figura 3c). Haga una lechada suelta girando y agitando con una varilla de vidrio (Figura 3d) hasta que todo el adsorbente esté completamente mojado, se liberen burbujas de gas y la consistencia sea algo espesa pero vertible.
Figura 4: a) Verter el purín en la columna, b) Enjuagar el matraz, c) Adsorbente adherido a los lados de la columna, d) Enjuagar el adsorbente adherido.
Figura 4: a) Verter el purín en la columna, b) Enjuagar el matraz, c) Adsorbente adherido a los lados de la columna, d) Enjuagar el adsorbente adherido.
  1. Ponga un vaso de precipitados o un matraz Erlenmeyer bajo la columna de sujeción y abra la llave de paso. En un rápido movimiento, se gira y se vierte la lechada de sílice o alúmina en la columna usando un embudo de boca grande (Figura 4a). Inmediatamente utilice más eluyente para enjuagar la lechada residual del matraz Erlenmeyer (Figura 4b) y para que llegue a la columna.
  2. Enjuague inmediatamente cualquier sílice o alúmina de los lados del depósito de la columna utilizando el eluyente y un movimiento giratorio de una pipeta Pasteur (Figura 4 c+d). Si se deja secar, el adsorbente se pegará al vidrio y no se enjuagará fácilmente.
Figura 5: a) Estrujar la columna para eliminar las burbujas de aire, b) Aplicar presión de aire, c) Añadir arena, d) Aclarar la arena de los lados.
Figura 5: a) Estrujar la columna para eliminar las burbujas de aire, b) Aplicar presión de aire, c) Añadir arena, d) Aclarar la arena de los lados.
  1. Golpear la columna con firmeza utilizando un anillo de corcho o los nudillos (figura 5a) para desalojar cualquier burbuja de aire en la columna (que podría causar una mala separación o el agrietamiento del adsorbente en la columna), y para promover una deposición uniforme del adsorbente.
  2. Aplicar una suave presión de aire en la parte superior de la columna (Figura 5b) para comprimirla, deteniéndose cuando el nivel de eluyente sea de 1cm desde la parte superior de la columna. Si se utiliza un adaptador en T con la línea de aire como en la figura 5b, se puede lograr un control fino del flujo de aire mediante el ajuste de la pinza de sujeción en el tubo de goma.

A lo largo de todo el proceso de elución, mantenga la columna blanca de adsorbente húmeda, con el nivel de eluyente por encima de la parte superior de la sílice o la alúmina.

Rompa suavemente el sello para dejar de aplicar presión y cierre la llave de paso para evitar que el líquido siga goteando.

  1. Añade una fina capa de arena (Figura 5c), de aproximadamente 0,5 cm de altura. Enjuagar los lados de la columna con eluyente usando un movimiento de remolino para desalojar la arena de los lados del vidrio (Figura 5d). Abrir la llave de paso y dejar que el líquido salga hasta que el líquido esté justo por encima de la capa de arena. Aplique presión de aire si el goteo es demasiado lento.

Añadir la muestra

Una vez que la muestra se aplica a la columna, hay una carrera contra el tiempo, ya que la difusión comenzará a ampliar el material. No se debe aplicar una muestra hasta que se esté listo para completar la columna inmediatamente y en su totalidad. ¡Este proceso puede tomar entre 15 y 90 minutos! Si se utilizan tubos de ensayo para recoger fracciones, los tubos de ensayo deben ser dispuestos en un bastidor antes de añadir la muestra, y la altura de la columna debe ser ajustada para que el bastidor de tubos de ensayo pueda deslizarse por debajo.

Figura 6: a) Disolución de un sólido con una pequeña cantidad de diclorometano, b) Aplicación de la muestra, c) Enjuague de la muestra en su matraz, d) Aplicación de presión para empujar la muestra en la columna justo después de la capa de arena.
Figura 6: a) Disolución de un sólido con una pequeña cantidad de diclorometano, b) Aplicación de la muestra, c) Enjuague de la muestra en su matraz, d) Aplicación de presión para empujar la muestra en la columna justo después de la capa de arena.
  1. Si la muestra cruda es un líquido, utilícela directamente (pase al paso 13).
  1. Si la muestra cruda es un sólido, haga una de las siguientes cosas:
    • Situación ideal: disolver el sólido en la mínima cantidad de eluyente (unos pocos mL como máximo).
    • Si el sólido no es particularmente soluble, o no se disuelve en unos pocos mL del eluyente, disolverlo en la mínima cantidad de diclorometano (pocos mL como máximo, figura 6a).
    • Si el sólido es insoluble en el eluyente, también es posible un procedimiento alternativo. Disolver el sólido en un matraz de fondo redondo utilizando unos pocos mL de un disolvente de bajo punto de ebullición (por ejemplo, diclorometano o acetona). Añada al matraz aproximadamente 1 g de sílice o alúmina, y luego retire el disolvente del evaporador rotatorio para dejar un sólido que contenga la muestra depositada en el adsorbente. Con una pulgada de eluyente descansando sobre la columna apilada (omitir la adición de la capa de arena si se utiliza este método), vierta la muestra de silicio absorbido sobre la columna utilizando un embudo de boca ancha. Si hay polvo adherido al vidrio, enjuague con más eluyente (vaya al paso 15.)
  1. Añada delicadamente la muestra a la columna mediante una pipeta, goteando el líquido o la solución directamente sobre la arena con la punta de la pipeta lo más cerca posible, no por los lados (Figura 6b). Tenga cuidado de no arrojar el líquido a la fuerza de manera que se produzcan hendiduras en la columna de arena o de sílice/alúmina.
  2. Enjuague el recipiente de la muestra con un poco de disolvente (o diclorometano si se utiliza, Figura 6c) y añada el enjuague a la columna utilizando la misma pipeta (para enjuagar también la pipeta).
  3. Abra la llave de paso y deje que el líquido salga hasta que la muestra pase justo por la capa de arena (Figura 6d) y entre en la zona blanca de la columna (aplique presión de aire si tarda más de 20 segundos).
  4. Enjuague suavemente los lados de la columna con un movimiento de remolino usando 1-2 pipetas -llenas de eluyente- para enjuagar cualquier muestra salpicada. Nuevamente, deje que el líquido gotee (o aplique presión de aire) hasta que la muestra sea empujada dentro del adsorbente blanco.

Repita el paso de enjuague hasta que se sienta seguro de que toda la muestra se deposita en el adsorbente. Si una parte de la muestra todavía se encuentra en la capa de arena, puede disolverse en el eluyente cuando se añada más disolvente, lo que provocará una pérdida de rendimiento. Si el compuesto es coloreado, el lavado debe ser completamente claro.

Figura 7: a+b) Llenar el depósito de disolventes, c+d) Elección de la columna.
Figura 7: a+b) Llenar el depósito de disolventes, c+d) Elección de la columna.

Rellenar con eluyente y eluir la columna

  1. Añada delicadamente más eluyente mediante la pipeta (Figura 7a), arremolinándose por los lados, y luego, cuando la capa de arena ya no se perturbe con las adiciones, vierta cuidadosamente cantidades mayores (Figura 7b) del eluyente preparado para llenar el depósito (o llene con todo lo que sea necesario). El eluyente limpio recogido durante el relleno de la columna puede ser reutilizado.
  2. Utilice la presión del aire para eluir suave y constantemente la muestra a través de la columna (Figuras 7 c+d). Cuantas más veces se inicie y se detenga la presión, más probable es que la columna se agriete. Lo mejor es que la presión se mantenga suave y constante todo el tiempo.

La tasa de goteo óptima durante la elución depende del tamaño de la columna. El flujo ideal de eluyente es cuando el disolvente en la sección cilíndrica de la columna por encima del adsorbente cae a una velocidad de 2,0 pulgadas por minuto.10 Por lo tanto, la tasa de goteo debe ser más lenta con una columna estrecha en comparación con una columna más ancha.

La tasa de goteo para una columna de una pulgada debe ser la que permita distinguir apenas las gotas individuales. Un chorro de líquido que sale de la llave de paso con este tamaño de columna es ligeramente demasiado rápido.

Figura 8: a-c) Recolección de fracciones
Figura 8: a-c) Recolección de fracciones

Recoger las fracciones

  1. Empiece inmediatamente a recoger el líquido eluyente en tubos de ensayo en un estante (Figura 8a). Véase en la tabla 2.5 las recomendaciones sobre los volúmenes a recoger en cada tubo de ensayo.
  2. Cuando se llene la primera probeta, o si se ha recogido una cierta altura de líquido como recomienda su instructor o la Tabla 2.5, mueva el bastidor para empezar a recoger en un tubo diferente (Figuras 8 b+c). Llene y mantenga los tubos en orden en el estante.

Estos diferentes tubos se llaman «fracciones». El objetivo de una columna es recoger fracciones lo suficientemente pequeñas que la mayoría (o algunas) fracciones contengan material puro. Si la separación de la mezcla es difícil (si el ΔRf de los componentes es bajo), puede ser mejor recolectar pequeñas fracciones (por ejemplo, tubos medio llenos).

Figura 9: a-c) Material de enjuague salpicado en la punta de la columna, d) Estudiantes corriendo una columna.
Figura 9: a-c) Material de enjuague salpicado en la punta de la columna, d) Estudiantes corriendo una columna.
  1. A medida que el líquido se escurre de la columna, a menudo salpica en el exterior de la punta de la columna, y cuando el disolvente se evapora se puede ver un anillo de material en la punta (se verá un anillo de sólido si el componente es un sólido como en la figura 9b, o gotitas aceitosas si el componente es un líquido). Si los componentes son de color, la punta de la columna debe ser enjuagada (Figura 9c) cuando parezca que un componente se ha eluido completamente y antes de que el otro componente se aproxime.
  2. Periódicamente se debe vigilar el nivel del eluyente y rellenar antes de que caiga por debajo de la capa de arena.
Figura 10: a) Elución, b) Adición de acetato de etilo para aumentar la polaridad del disolvente, c) Nivel de disolvente cerca de la capa de arena, d) Relleno.
Figura 10: a) Elución, b) Adición de acetato de etilo para aumentar la polaridad del disolvente, c) Nivel de disolvente cerca de la capa de arena, d) Relleno.

Posibilidad de aumentar la polaridad de los disolventes

  1. Se puede utilizar un eluyente en toda la columna, especialmente si los componentes que se van a separar tienen valores de Rf similares. Sin embargo, si los componentes tienen valores Rf muy diferentes, la polaridad del disolvente puede aumentar después de que un componente haya eluido de la columna (figura 10a).

El aumento de la polaridad del disolvente hará que los componentes viajen «más rápido». Hay varias razones por las que se desea una elución más rápida. En primer lugar, si un componente ya ha salido de la columna, ésta ya ha hecho su trabajo con la separación, por lo que la aceleración del proceso no afectará a la pureza de las fracciones recogidas. En segundo lugar, cuanto más tiempo se tarda en hacer funcionar una columna, más amplias serán las bandas de los componentes (debido a la difusión), y la recogida de una banda ancha de material utilizará (y desperdiciará) mucho disolvente.

En la tabla 2 figura una lista parcial de las series eluotropicas, una lista de disolventes comunes clasificados según su «poder disolvente» en la cromatografía en fase normal. El disolvente más polar causa el aumento más dramático de Rf.

Tabla 2: Serie Eluotrópica.
Tabla 2: Serie Eluotrópica.
  1. Para aumentar la polaridad del disolvente, el disolvente polar puede gotear directamente en el eluyente del depósito de la columna (Figura 10b). Por ejemplo, si se utiliza una mezcla hexanos: acetato de etilo, la adición de acetato de etilo puro al eluyente que se encuentra actualmente en el depósito aumentaría su polaridad. Si el nivel del eluyente se está reduciendo, se podría preparar una solución que contenga un porcentaje mayor del componente más polar. Por ejemplo, si la columna utilizara primero una mezcla de 4:1 hexanos: acetato de etilo, la utilización de una mezcla de 1:1 sería un disolvente más polar.
  2. Eluye la columna con el disolvente más polar como antes, y recuerde siempre vigilar el nivel de eluyente, y rellénela (Figura 10d) antes de que caiga por debajo de la capa de arena.
Figura 11: a) Placa de TLC original, b) Fracciones recogidas por la columna, c) Colocación de las fracciones en una placa de TLC, d) Una placa de TLC visualizada de muestras de cada fracción
Figura 11: a) Placa de TLC original, b) Fracciones recogidas por la columna, c) Colocación de las fracciones en una placa de TLC, d) Una placa de TLC visualizada de muestras de cada fracción

Encontrar y concentrar el componente deseado

  1. Para encontrar el componente deseado en las fracciones de tubo de ensayo, es útil comprender la relación entre el Rf y el orden de elución en la cromatografía en columna.

En la cromatografía en columna, la muestra se deposita en la parte superior de la columna y se eluye hacia abajo, mientras que en la cromatografía en capa fina la muestra se deposita en la parte inferior de la placa y se elude hacia arriba. Por lo tanto, una columna puede ser pensada como una placa de TLC al revés. Un compuesto con un Rf más alto corre «más rápido», lo que significa que terminará más alto en una placa de TLC, y se recogerá primero con una columna.

En la columna que se muestra en esta sección, el componente con el Rf más bajo (naranja en la placa de TLC en la Figura 11a), es el componente recogido en segundo lugar de la columna.

  1. Primero determine qué tubos de ensayo contienen el compuesto disuelto.
    • Coloque una muestra de cada fracción en una placa de TLC etiquetada con los números de las fracciones correspondientes al orden en que fueron recolectadas (Figura 11c). Puede ser mejor colocar cada muestra 2 ó 3 veces una encima de la otra en caso de que las fracciones estén diluidas.
    • Si se han recogido muchas fracciones, lo que hace que se dude en muestrear cada fracción, un método para identificar las fracciones incoloras que pueden contener compuesto es buscar un indicio de residuo en la parte superior de los tubos de ensayo. Después de la evaporación, un residuo sólido (Figura 12) o gotitas aceitosas se dejan a veces en la parte superior del tubo de ensayo, lo que hace evidente que esas fracciones contienen algo más que un simple disolvente. Tome una muestra de todas las fracciones cercanas a los tubos que contienen residuos visibles.
Figura 12: Anillo de sólido visto en los bordes de los tubos después de la evaporación
Figura 12: Anillo de sólido visto en los bordes de los tubos después de la evaporación

Visualice la placa TLC manchada usando luz UV y/o una mancha para determinar qué fracciones contienen compuesto (Figura 11d).

Figura 13: a) Placas de TLC eludidas de fracciones que contienen un posible compuesto, b) Combinación de fracciones, c) Enjuague de un tubo de fracción.
Figura 13: a) Placas de TLC eludidas de fracciones que contienen un posible compuesto, b) Combinación de fracciones, c) Enjuague de un tubo de fracción.
  1. Haz una cromatografía de todas las fracciones que contienen el compuesto, detectando hasta cinco muestras por cada placa de cromatografía de una pulgada de ancho. Se pueden utilizar placas de TLC más anchas para este propósito si están disponibles.
  2. Identificar el compuesto con el Rf deseado en comparación con la placa original de TLC en bruto. Elija retener las fracciones que tienen el compuesto deseado en forma pura, como se evidencia en la placa de TLC eluido. Por ejemplo, si el compuesto con el mayor Rf en la figura 13a, se deben mantener las fracciones 6-10.
  1. Combinar las fracciones puras en un matraz de fondo redondo de tamaño apropiado (no más de medio lleno, figura 13b). Enjuagar cada tubo de ensayo con una pequeña cantidad de eluyente (u otro disolvente si hay problemas de solubilidad) y añadir el enjuague al matraz de fondo redondo (figura 13c).
  2. Evaporar el disolvente en el evaporador rotativo para dejar el compuesto purificado en el matraz.
Figura 14: a) Usando la presión del aire para secar la columna, b) Permitiendo que la columna se seque al revés, c) Recogiendo los residuos de sílice.
Figura 14: a) Usando la presión del aire para secar la columna, b) Permitiendo que la columna se seque al revés, c) Recogiendo los residuos de sílice.

Limpiar la columna

  1. Para secar la columna, aplique presión de aire para drenar la mayor parte del eluyente de la columna en un contenedor de desechos. A continuación, secar más la columna utilizando uno de estos métodos:
    • Deje conectado un suave chorro de aire que corre a través de la columna para secarla aún más mientras limpia otras cosas (Figura 14a).
    • Ponga la columna boca abajo sobre un gran vaso de residuos en la campana extractora, para que el adsorbente caiga cuando se haya secado (Figura 14b). Esto llevará mucho tiempo (hasta el próximo período de clases), pero es una opción.
  2. Una vez seco, el adsorbente se puede verter fuera de la columna en un contenedor de desechos en la campana extractora (figura 14c).

Nota de seguridad: Los adsorbentes en polvo son un irritante pulmonar, y su peligro se agrava si la columna contiene compuestos residuales que ahora pueden llegar a los pulmones. El vertido de polvos de sílice o alúmina debe hacerse siempre en la campana de gases.

  1. Cuando la mayoría del adsorbente se haya recogido en un recipiente de desechos, utilice agua para enjuagar cualquier sólido residual en el fregadero, y luego enjuague la columna con acetona en un vaso de desechos. Luego limpie la columna con agua y jabón y séquela con las partes de la llave de paso separadas.

Paso a paso – Cromatografía en columna

Cromatografía en columna paso a paso

  1. Asegúrate de que haya un tapón de frita o de algodón en la parte inferior de la columna. Llene la columna con sílice o alúmina hasta 5-6 pulgadas en la campana extractora.

  2. Vierta el adsorbente en un frasco Erlenmeyer y añada el eluyente para hacer una mezcla vertible. El eluyente debe dar al componente deseado un Rf de 0.35 por cromatografía en capa delgada o TLC.

  3. Vierte la mezcla e inmediatamente enjuaga los lados de la columna con eluyente y una pipeta. Golpee la columna para eliminar las burbujas de aire. Usen la presión de aire para llenar la columna. Manténgala perfectamente vertical.

  4. Añade 0,5 cm de arena. Enjuague la arena de los lados con cuidado con un movimiento giratorio. No altere la superficie superior de la sílice o la alúmina con el enjuague.

  5. Ajustar el nivel de eluyente a la capa de arena, y luego agregar la muestra (líquido puro, disuelto en CH2Cl2, o sólido adsorbido en una porción de sílice). Enjuague los lados y use la presión del aire para forzar el eluyente hacia abajo en la capa de sílice/alúmina.

  6. Llene el depósito con eluyente (con cuidado de no perturbar la superficie superior). Use una presión de aire constante para eluir la columna. Recoger las fracciones en tubos de ensayo en un estante (mantener el orden).

  7. Enjuague la punta de la columna si un componente ha terminado de salir de la columna. Posiblemente aumente la polaridad del eluyente para que los componentes se eluyan más rápido. Nunca permita que el eluyente caiga por debajo de la parte superior de la columna de adsorción.

  8. Use la TLC para determinar la pureza de las fracciones, y combine las fracciones apropiadas. Retire el disolvente con el evaporador rotativo.

Resolución de problemas de cromatografía en columna

La pipeta se rompió en la columna

Es bastante común romper la punta de una pipeta Pasteur mientras se enjuaga la columna, que a menudo cae y se acuña en la delicada columna. Desafortunadamente, una pipeta rota en una columna puede causar problemas con la separación de los componentes.

Figura 15: Efecto de una pipeta rota en una columna.
Figura 15: Efecto de una pipeta rota en una columna.

Por ejemplo, la figura 15 muestra el efecto de una pipeta rota en la separación de dos componentes. Una pipeta rota está incrustada en la columna y es la línea casi vertical de color naranja que se ve entre las dos bandas de la columna. Como el equilibrio de fase estacionario-móvil no se produce en la superficie de vidrio de la pipeta, los compuestos bajan rápidamente y se mueven más rápido de lo que deberían en base a su Rf. La línea vertical anaranjada es el componente superior que drena en la banda del componente inferior, contaminándolo.

Si una pipeta rota atraviesa la columna, y la arena o la muestra aún no se ha aplicado, intente retirar la pipeta con una pinza larga. Después de retirarla, empujen vigorosamente la columna para volver a empaquetarla y continuar con la columna. Si la pipeta no puede ser retirada con las pinzas, puede considerar la posibilidad de rehacer la columna.

Si ya se ha aplicado la arena, al retirar la pipeta y empujar la columna a menudo se arruinará la superficie horizontal del adsorbente, por lo que será necesario volver a empaquetar la columna. En caso que la muestra ya ha sido aplicada, no hay nada que hacer sino continuar y esperar lo mejor. Si la columna resulta en una separación infructuosa, se pueden combinar todas las fracciones que contienen el compuesto de interés, evaporando el disolvente por el evaporador rotativo, y se puede intentar otro método de purificación (o una segunda columna).

Las burbujas de aire se ven en la columna

Figura 16: Efecto de una burbuja de aire en la separación de una columna
Figura 16: Efecto de una burbuja de aire en la separación de una columna

Como una pipeta rota, una burbuja de aire es una cavidad vacía donde no se produce el equilibrio de fase estacionaria-móvil, por lo que los componentes se mueven más rápido de lo que deberían alrededor de una burbuja de aire. Esto puede dar lugar a bandas de elución desiguales, que pueden causar solapamiento si la separación de la mezcla es difícil (si los componentes tienen valores de Rf muy cercanos, como en la figura 16).

Si se ven burbujas de aire en la columna y la arena o la muestra aún no se ha aplicado, dele a la columna un buen empujón durante el empaquetamiento para eliminar todas las burbujas de aire. Vea a su instructor si las burbujas no se mueven ya que puede estar abordando la tarea con demasiada delicadeza. Si la arena o la muestra ya se ha aplicado, es mejor dejar la columna como está y esperar que las burbujas de aire no afecten la separación.

Las bandas se desplazan de manera desigual

Si los componentes de una mezcla son coloreados, puede ser obvio cuando las bandas se eluden de manera torcida. Esto se debe probablemente a que la columna está sujeta en una ligera diagonal.

Si la columna está sujeta de forma inclinada, los componentes se desplazan de forma oblicua (Figura 17). Esto puede causar problemas de separación si los componentes tienen un Rf similar.

Figura 17: Efecto de una columna torcida en la separación.
Figura 17: Efecto de una columna torcida en la separación.

No hay forma de arreglar este problema a mitad de una columna, pero si los componentes tienen valores de Rf muy diferentes, las bandas inclinadas pueden no tener efecto en la separación. En el futuro, asegúrese de comprobar que la columna está perfectamente vertical tanto en el sentido de lado a lado como en el sentido contrario.

Para más información 2.3A: Macroscale Columns

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Como citar este artículo:

APA: (2020-12-02). Cromatografía en columna. Recuperado de https://quimicafacil.net/tecnicas-de-laboratorio/cromatografia-en-columna/

ACS: . Cromatografía en columna. https://quimicafacil.net/tecnicas-de-laboratorio/cromatografia-en-columna/. Fecha de consulta 2024-03-28.

IEEE: , "Cromatografía en columna," https://quimicafacil.net/tecnicas-de-laboratorio/cromatografia-en-columna/, fecha de consulta 2024-03-28.

Vancouver: . Cromatografía en columna. [Internet]. 2020-12-02 [citado 2024-03-28]. Disponible en: https://quimicafacil.net/tecnicas-de-laboratorio/cromatografia-en-columna/.

MLA: . "Cromatografía en columna." https://quimicafacil.net/tecnicas-de-laboratorio/cromatografia-en-columna/. 2020-12-02. Web.

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